福州大学解析叶绿体解离酶特异剪切DNA底物的分子机制

2019年10月14日，来自福州大学的林忠辉教授研究团队在Nature Chemical Biology上在线发表了题为Structural Basis of Sequence-specific Holliday Junction Cleavage by MOC1的研究论文，揭示了MOC1特异识别和切割DNA底物的分子机制。

该研究首先通过一系列生化实验确定了MOC1特异的DNA底物序列，随后利用X-射线晶体学的方法解析了来自玉米（Zea mays）的MOC1蛋白及其与DNA底物在不同金属离子条件下分辨率高达1.68 Å的复合物晶体结构。这些晶体结构表明，MOC1蛋白在三维结构上与噬热菌Thermus thermophilus RuvC具有高度相似性，进一步证明了叶绿体是起源于光合细菌的内共生学说。此外，MOC1蛋白还拥有其独特的β-hairpin基序，仿佛一双手将HJ DNA的“腰部”拥抱。另外，研究还揭示了MOC1对DNA序列5’-C2C1↓C0-3’的特异识别是通过一个保守的碱基识别基序（Base Recognition Motif，BRM）而实现的。BRM上的一个苯丙氨酸通过π-π作用与C2和C1形成“三明治夹层”构象，从而诱导C1-G1′碱基对分开并使G1′发生碱基翻转（Base flipping），而C1则与BRM上的天冬氨酸侧链形成伪碱基对（pseudobase-pair）。此外，该研究还发现MOC1的活性中心能同时结合两个金属离子，在催化上依赖于双金属离子催化机制（Two-metal ion catalysis）。

图1. MOC1与HJ的复合物晶体结构

有意思的是，在催化中心，与金属离子配位的其中一个氨基酸残基正好位于BRM的N端，提示MOC1对序列的特性识别与金属离子的配位之间可能相互关联。为了证明这一推测，合作者李金宇课题组进行了分子动力学模拟，发现当MOC1与非特性DNA底物结合时，BRM会发生构象变化，从而促使金属离子与催化中心的配位发生偏离，进而导致MOC1酶活性减弱甚至丧失。

图2. 分子动力学模拟揭示DNA底物序列不同引起金属离子配位的变化

总之，该研究结合了结构生物学、计算生物学和大量的生化数据不仅在原子水平上揭示了HJ解离酶——MOC1的催化机制，而且对RuvC家族悬而未决的底物特异性识别机制也提供了重要的启示。更为重要的是，该研究针对关于核酸酶如何将DNA序列上的微小差异转化成为其催化活性上的巨大不同这一科学问题，创新性地提出了一种双金属离子辅助的DNA序列特异选择性机制。

据悉，福州大学化学学院林忠辉教授、黄明东教授和李金宇教授为该论文共同通讯作者，博士生林华建、科研助理张丹萍和左柯为共同第一作者，其中林华建由林忠辉教授和黄明东教授共同指导。袁彩副教授参与了晶体结构的修正工作。

林忠辉课题组成员

研究背景

Holliday junction（HJ）是英国分子生物学家Robin Holliday于1964年首次发现，是在DNA同源重组损伤修复过程中形成的一种十字叉状的DNA连接体，在噬菌体、细菌、真菌、植物乃至动物细胞中均存在。在DNA损伤修复完成后，HJ必须在HJ解离酶的作用下解离，从而促使两条同源DNA双链分开重新成为线性DNA。

MOC1（monokaryotic chloroplast 1）是一个叶绿体特异的HJ解离酶。叶绿体拥有自己的一套基因组，能够独立进行基因的表达和翻译。由于叶绿体是光合作用的场所，其DNA（cpDNA）被暴露于高水平的活性氧中，尤其容易发生DNA双链断裂等损伤，因此特别需要包括MOC1在内的DNA损伤修复蛋白以确保其基因组的稳定性。与其它已报道的HJ解离酶相比，MOC1对底物的选择性更强，它专一性地剪切具有十字叉结构并且在十字叉中心含有5’-T/CC↓C-3’序列（↓代表切割位点）的HJ-DNA。那么，MOC1蛋白在三维结构上究竟具有什么独特的特征，使其对底物识别和剪切具有如此专一的选择性呢？另外，尽管HJ解离酶与HJ-DNA的结合是非序列特异性的，但是在催化活性上，底物DNA序列上的微小差异（甚至是一个碱基的不同）将会导致其催化效率上的巨大差别（>200倍），这其中又隐藏着什么特殊的催化调控机制呢？